6
ELEKTROCHEMICKÁ ANALÝZA
V PRIETOKOVÝCH SYSTÉMOCH
(
FLOW ANALYSIS)

Rozličné elektrochemické detektory (ďalej ED) je možné zaradiť aj do prietokových systémov. Používajú sa viaceré typy ED, pričom ich rozlišujeme podľa toho, či monitorujú :

Najrozšírenejšie sú ED pracujúce s konštantným potenciálom, ktoré vykazujú pozoruhodnú citlivosť (až na úroveň pg !), vysokú selektivitu (voči elektroaktívnym látkam), široký lineárny rozsah, nízky "mŕtvy objem", rýchlu odozvu  –  a na dôvažok sú relatívne lacné. V praxi sa ED užívajú najmä v spojení s automatizovanými prietokovými systémami (napr. s prietokovou injekčnou analýzou FIA podľa flow injection analysis) alebo so separačnými technikami (najmä s vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou HPLC podľa  high performance liquid chromatography a najnovšie s kapilárnou zónovou elektro-forézou a on-line mikrodialýzou). Práve kombináciou ED so separačnými technikami sa môžeme dopracovať k dobrým výsledkom aj v prípade veľmi zložitých vzoriek.

Princíp

Najčastejšie sa elektrochemická detekcia v prietokových systémoch realizuje tak, že pracovná elektróda sa udržuje pri konštantnom potenciáli z oblasti limitného prúdu pre daný analyt a sleduje sa prúd ako funkcia času. Táto technika sa označuje ako prietoková ampérometria (flow amperometry).

Prúdová odpoveď pri prietokovej ampérometrii bude zodpovedať koncentrácii elektroaktívnej látky práve prechádzajúcej detektorom. Napr. pri LC (kvapalinová chromatografia) alebo FIA systémoch pozorujeme ostré prúdové píky, ktoré zodpovedajú eluovanému analytu alebo zóne vzorky. Výška píku zodpovedá koncentrácii analytu (obr. 6.1).

Vyššie prúdy pozadia (očakávané najmä pri vyšších hodnotách vloženého potenciálu) zvyšujú úroveň šumu, závislého od prietokovej rýchlosti kvapaliny. Zvláštnym prípadom je nepriaznivý vplyv stôp kyslíka v pretekajúcom roztoku najmä na katodickú detekciu redukovateľných látok. Nedostatky vo fungovaní pumpy v prietokovom systéme taktiež zvyšujú úroveň šumu.

Selektivita ampérometrických meraní je ovplyvnená hodnotou potenciálu (potenciálového rozdielu) vloženého na pracovnú elektródu. Vo všeobecnosti môžeme povedať, že nižšie hodnoty sú selektívnejšie, kým vyššie sú skôr univerzálnejšie (lebo vyhovujú viacerým látkam).

Pri voľbe vhodného potenciálu pre detekciu vychádzame z tzv. hydrodynamického voltampérogramu. Tento zostrojíme tak, že opakovane dávkujeme (injektujeme) analyt o konštantnej  koncentrácii  do prietokového systému, pričom  registrujeme  prúdové  odpovede

Obr. 6.1.
Kalibračná závislosť etanolu na enzýmovej uhlíkovej pastovej elektróde pri prietokovej ampérometrii. Píky (a) až (h) zodpovedajú 2 . 10-5 až 1 . 10-4 mol/l EtOH.
Obr.6.2.
Hydrodynamický voltampérogram

pri rôzne nastavených hodnotách potenciálov. Výsledný voltampérogram zostavený z experimentálnych bodov má charakteristický vlnový (sigmoidálny) tvar (obr. 6.2). Pre meranie vzoriek volíme najčastejšie potenciál z oblasti limitného prúdu, ale nie vždy, lebo aj voľbou menšieho potenciálového rozdielu (z oblasti stúpajúcej časti vlny) môžeme zvýšiť selektivitu stanovenia, prípadne aj znížiť medzu stanoviteľnosti (detekčný limit).

Dôležité kvalitatívne informácie môžeme získať porovnaním hydrodynamických voltampérogramov vzorky a štandardných roztokov. V závislosti od účinnosti konverzie (premeny) delíme ED do dvoch kategórií :

Zvýšená účinnosť konverzie v prípade coulometrických detektorov však platí aj v prípade redox reakcií pozadia (šumu), takže neznamená to lepšiu medzu stanoviteľnosti.

Konštrukcia nádobiek

Dnes poznáme veľký výber rozlične usporiadaných prietokových nádobiek (obr. 6.3, ďalšie nádobky v odporúčanej literatúre). Konštrukcia nádobky musí vyhovovať nasledovným požiadavkám :


Obr. 6.3    
zne vyhotovenia prietokových nádobiek, podľa G. Henze, R. Neeb: Elektrochemische Analytik, Springer Verlag, Berlin 1986, str. 155

  1. nádobka s pracovnou elektródou zo sklovitého uhlíka (GC) a pomocnou Pt elektródou, referenčná  elektróda je namontovaná do výpustu (nevidieť)
  2. nádobka so stacionárnou ortuťovou elektródou (pracovnou)(1)-prítok, (2)-odtok, (3)-referenčná elektróda, (4)-pomocná Pt elektróda (prstenec), (5)-membrána, (6)-kladivo (odbíjač kvapiek), (7)-rezervoár pre ortuťové kvapky
  3. nádobka s pracovnou elektródou (W) zo sklovitého uhlíka alebo z uhlíkovej pasty, A - pomocná elektróda,  R - referenčná elektróda
  4. nádobka s miešadlom (G) a s pracovnou elektródou z porézneho uhlíka (C), A, B  -  prívod a odvod, D  -  vodič, E  -  referenčná elektróda, F  -  pomocná elektróda (Pt drôt)

 

tubulárny

wall–jet

tenká vrstva

Obr. 6.4   Typ detektoru podľa usporiadania a tvaru indikačnej elektródy

Referenčná a pomocná elektróda musia byť umiestnené po prúde (downstream, doslovne dolu prúdom) kvapaliny vzhľadom k pracovnej elektróde, aby reakčné produkty z pomocnej elektródy alebo elektrolyt vytekajúci (difundujúci) z referenčnej elektródy nerušil stanovenie na pracovnej elektróde.

Veľmi často sa používajú nasledovné typy detektorov (obr. 6.4):

Existujú aj detektory, kde kvapalina prúdi okolo stacionárnej ortuťovej kvapkovej elektródy alebo obteká mikroelektródu z uhlíkového vlákna. V coulometrických detektoroch sa používajú prietokové tubulárne elektródy alebo elektródy z porézneho materiálu (pozri RVC v stati 4.2.2).

Pri analýze veľmi malých objemov sa môžu použiť aj ultramikroelektródy (napr. pri kapilárnej elektroforéze, obr. 6.5).  Na ultramikroelektródach pozorujeme veľmi malý šum a môžeme ich použiť aj v málo vodivých roztokoch.


Obr. 6.5.
Schéma ampérometrického detektora z uhlíkového vlákna pre kapilárnu elektroforézu

K
B
C
R
W
kapilára z kremenného skla
kvapka eluentu
platňa z nehrdzavejúcej ocele, funguje zároveň ako pomocná elektróda A
referenčná elektróda
pracovná elektróda (na konci má uhlíkové vlákno)



Obr. 6.6   Ilustrácia k vzťahu (6.1)

Geometrické usporiadanie a konštrukcia nádobiek musí zaručovať dobre definované hydrodynamické podmienky. Transport elektroaktívnej látky k elektróde je zabezpečený kombináciou konvekcie a difúzie, a túto okolnosť je treba rešpektovať pri odvodzovaní rovníc pre limitný prúd registrovaný v jednotlivých typoch nádobiek. Podrobnejšie o tejto problematike pojednáva napr. K. Štulík, V. Pacáková: Elektroanalytická měření v proudících kapalinách, SNTL, Praha 1989, str. 66-69. Ako príklad môžeme uviesť vzťah, ktorý platí pre nádobku typu  wall-jet :

ilim = 1,15  n F D2/3 u –5/12  a  R3/4  c (6.1)
kde

a
R
je kinematická viskozita
priemer vstupnej trubice
polomer elektródy
ostatné symboly majú obvyklý význam

V prípade coulometrických detektorov (so 100 %-nou elektrolýzou) je limitný prúd daný Faradayovým zákonom :

il = n F c U (6.2)

kde U je priemerná objemová prietoková rýchlosť kvapaliny a c je koncentrácia analytu.


Spôsoby detekcie v prietokových systémoch

Najjednoduchší spôsob (aj najčastejšie používaný) je meranie prúdu pri konštantnom potenciáli. Výhodou konštantného potenciálu na pracovnej elektróde je absencia kapacitných prúdov a preto takto môžeme docieliť extrémne nízke hodnoty pre medze stanoviteľnosti, a síce 1 až 100 pg (t.j. okolo 10-14 mol) analytu.

Niekedy je výhodné meniť potenciál elektródy počas merania (v takom prípade volíme DC, DP, AC alebo SW záznam), lebo takýmto spôsobom dostaneme omnoho viac informácií o elektroaktívnych látkach v roztoku. Takéto detektory nazývame voltampérometrické.

Detekčný limit u voltampérometrických detektorov je síce vyšší v porovnaní s meraním pri konštantnom potenciáli, zato pozorujeme lepšiu selektivitu, lebo zakaždým sa zaregistruje celý voltampérogram, charakteristický pre daný analyt (prípadne celé spektrum analytov).

Zvlášť výhodný je tento spôsob vtedy, ak sa v predchádzajúcom separačnom stupni jednotlivé analyty iba nedostatočne oddelili (ak koeluujú). Iný detektor (napr. vodivostný) by registroval v takom prípade iba jediný pík, zatiaľ čo voltampérometrický detektor môže v tom (jemne nerozlíšenom) "jedinom" píku odhaliť viacero elektroaktívnych látok, reagujúcich pri rôznych potenciáloch (napr. dopamín a normetanefrín na obr. 6.10).

Pulzová ampérometrická detekcia (PAD) bola zavedená za tým účelom, aby sa elektrochemickým čistením (zavádzaním tzv. čistiacich potenciálových pulzov medzi jednotlivými meraniami) udržiaval povrch elektród v aktivovanom stave. (Platí to najmä pre elektródy z ušľachtilých kovov - Pt, Au.)

Pri tejto metóde sa na elektródu opakovane (s frekvenciou 1 - 2 Hz) privádza trojstupňový potenciálový pulz naznačený na obr. 6.7.


Obr.  6.7.
Tvar ampérometrického trojitého pulzu s konštantným potenciálom pri meraní (interval merania značený ako m)

Iný tvar ampérometrického pulzu s lineárne premenlivým potenciálom počas merania (obr. 6.8) sa používa nielen v prietokových systémoch, ale aj pri intracelulárnej voltampérometrii s ultramalými Pt elektródami (pri meraní dopamínu in vivo v neuróne slimáka & ) . Potenciál sa mení lineárne od počiatočnej hodnoty  Ei   po  E rýchlosťou v = 200 mV/s. Anodické oxidatívne čistenie prebieha pri potenciáli Ea počas doby ta, nasleduje katodická reaktivácia (rozpustenie oxidu z povrchu elektródy) pri potenciáli  Epo dobu tc.


Obr. 6.8
Tvar periodicky sa opakujúcich pulzov s lineárne premenlivým potenciálom (tzv.
linear potential sweep-pulsed voltammetry) –
bližšie v texte

 


Obr. 6.9.
Trojrozmer
ný záznam prúdu ako funkcia potenciálu a času. A - 2,3-dinitrofenol,  B - p-nitrofenol,  C - m-nitrofenol, (pracovná elektróda SMDE, referenčná Ag/AgCl, pomer signál/šum = 8,4)


Obr. 6.10.
SW chromatovoltampérogram  1 . 10
-5
mol/l norepinefrínu (NE), dopamínu (DA) a normetanefrínu (NMN) (prietoková rýchlosť  1 ml/min., opakovanie záznamu každé   2 s,  D E = 25 mV,  fSW = 100 Hz)

Vďaka rýchlemu spôsobu záznamu voltampérogramov je možné zaznamenať viacero kriviek (voltampérogramov) počas prechodu vzorky detektorom. Môžeme takto získať trojrozmerný záznam  i - E - t  (obr. 6.9  a  6.10), na ktorom možno ľahko identifikovať aj píky látok, ktoré prechádzajú detektorom súčasne, alebo iba s nepatrným posunom (takéto látky sa chromatograficky iným ako voltampérometrickým detektorom nedajú rozlíšiť).

Niekedy zaraďujeme do ED dve aj viac pracovných elektród (obr. 6.11), pričom na každú privádzame iný potenciál. Aj v takom prípade dostaneme trojrozmerný chromatovoltampéro-gram (obr. 6.12).


Obr. 6.11
Elektródy pre 16-kanálové ampérometrické detektory

  1. zlatá mikrozväzková elektródová plocha, vytvorená fotolitografickou technikou (prerušovanou čiarou je  označená plocha, ktorá je v styku s roztokom)
  2. súbor indikačných elektród W1 až W16, usporiadaných do kruhu okolo trysky, privádzajúcej roztok, A je  pomocná elektróda

 


Obr.  6.12
Trojrozmerný chromatovoltampérogram pre oxidovateľné biologicky aktívne látky, registrovaný viackanálovým ampérometrickým detekčným systémom pozostávajúcim zo 16-ich uhlíkových pastových elektród, na ktoré boli privedené na obrázku vyznačené hodnoty konštantných potenciálov